Jak gramovat (s obrázky)

Obsah:

Jak gramovat (s obrázky)
Jak gramovat (s obrázky)

Video: Jak gramovat (s obrázky)

Video: Jak gramovat (s obrázky)
Video: Teaching Emotionally Disturbed (Behavior) Students 2024, Březen
Anonim

Gramové barvení je rychlý postup používaný ke zjištění přítomnosti bakterií ve vzorcích tkání a k charakterizaci bakterií jako grampozitivních nebo gramnegativních na základě chemických a fyzikálních vlastností jejich buněčných stěn. Gramovo barvení by mělo být téměř vždy provedeno jako první krok při diagnostice bakteriální infekce.

Gramovo barvení je pojmenováno podle dánského vědce Hanse Christiana Grama (1853 - 1938), který tuto techniku vyvinul v roce 1882 a v roce 1884 ji publikoval jako metodu pro rozlišení dvou typů bakterií s podobnými klinickými příznaky: Streptococcus pneumoniae (také známý jako pneumokok) a bakterie Klebsiella pneumoniae.

Kroky

Část 1 ze 3: Příprava gramové skvrny

Gram Stain Krok 1
Gram Stain Krok 1

Krok 1. Připravte se na laboratorní práci

Nasaďte si rukavice a svažte dlouhé vlasy, abyste zabránili kontaminaci vzorku bakterií, který budete testovat. Dezinfikujte pracovní prostor pod digestoří nebo v jiném dobře větraném prostoru. Než začnete, zkontrolujte, zda je bunsen hořák a mikroskop funkční.

Gram Stain Krok 2
Gram Stain Krok 2

Krok 2. Sterilizujte sklíčko mikroskopu

Pokud je sklíčko znečištěné, omyjte ho v mýdlové vodě, abyste odstranili mastnotu a nečistoty. Dezinfikujte sklíčko ethanolem, čističem skla nebo jakoukoli metodou doporučenou vaší laboratoří.

Gram Stain Krok 3
Gram Stain Krok 3

Krok 3. Přidejte vzorek na snímek

Pomocí metody Gramova barvení můžete pomoci identifikovat bakterie přítomné v lékařských vzorcích nebo bakteriální kultury pěstované v Petriho misce. Aby bylo Gramovo barvení užitečné, přidejte a tenký vrstva vzorku na skvrnu. Doporučuje se vzorek mladší 24 hodin, protože starší bakterie mohou mít poškozené buněčné stěny, které méně gramově reagují na gramové barvení.

  • Pokud používáte vzorek tkáně, přidejte 1–2 kapky na skleněné podložní sklíčko. Rovnoměrně rozetřete na podložní sklíčko a vytvořte tenký nátěr pomocí okraje druhého sterilizovaného skleněného podložního sklíčka. Před pokračováním nechte uschnout na vzduchu.
  • Pokud odebíráte bakterie z Petriho misky, sterilizujte očkovací smyčku plamenem Bunsenova hořáku, dokud nezáří, a poté ji nechte vychladnout. Naneste na něj kapku sterilní vody na podložní sklíčko, poté sterilizujte a ochlaďte smyčku, než přenesete malý vzorek bakterií a jemně promícháte do vody.
  • Bakterie ve vývaru by měly být smíchány ve vortexu, poté přidány očkovací smyčkou, jak je uvedeno výše, bez přidání další vody.
  • Pokud máte vzorek tamponu, tampón lehce přejeďte přes podložní sklíčko.
Gram Stain Krok 4
Gram Stain Krok 4

Krok 4. Teplem fixujte nátěr

Teplo zafixuje bakterie na podložní sklíčko, takže se během skvrny tak snadno nesmyjí. Rychle projděte sklíčko dvakrát až třikrát plamenem Bunsenova hořáku nebo jej zahřejte na elektrickém ohřívači skluzavek. Nepřehřívejte, aby nedošlo ke zkreslení vzorků. Pokud používáte Bunsenův hořák, plamen by měl být malý modrý kužel, ne vysoký oranžový.

Alternativně může být nátěr místo toho fixován methanolem, přidáním 1-2 kapek methanolu na vysušený nátěr, odsátím přebytečného methanolu a ponecháním uschnout na vzduchu. Tato metoda minimalizuje poškození hostitelských buněk a poskytuje čistší pozadí

Gram Stain Krok 5
Gram Stain Krok 5

Krok 5. Umístěte sklíčko na barvicí podnos

Barvící miska je mělká kovová, skleněná nebo plastová mísa s malou mřížkou nebo drátěnou podpěrou, která prochází přes vrchol. Umístěte sklíčko na horní část této podpěry, aby kapaliny, které budete používat, mohly odtékat dolů do zásobníku.

Pokud nemáte misku na barvení, lze sklíčko umístit přímo na plastový tácek na kostky ledu

Část 2 ze 3: Provedení Gramových skvrn

Gram Stain Krok 6
Gram Stain Krok 6

Krok 1. Potřete nátěr krystalovou fialkou

Pomocí pipety zaplavte vzorek bakterií několika kapkami krystalově fialového barviva, někdy nazývaného hořec fialová. Počkejte třicet až šedesát sekund. Krystalová fialová (CV) se ve vodných roztocích disociuje na ionty CV+ a chloridové (Cl–). Tyto ionty pronikají buněčnou stěnou a buněčnou membránou grampozitivních i gramnegativních buněk. Ion CV+ interaguje s negativně nabitými složkami bakteriálních buněk, aby buňky zbarvil purpurově.

Mnoho laboratoří používá krystalovou fialku „Hucker“, která přidává šťavelan amonný, aby se zabránilo srážení

Gram Stain Krok 7
Gram Stain Krok 7

Krok 2. Krystalovou fialku jemně opláchněte

Nakloňte sklíčko a pomocí mycí lahve stříkněte přes horní část sklíčka malý proud destilované nebo kohoutkové vody. Voda by měla stékat po povrchu nátěru, ale neměla by na něj mířit přímo. Neoplachujte nadměrně, mohlo by dojít k odstranění skvrn od grampozitivních bakterií.

Gram Stain Krok 8
Gram Stain Krok 8

Krok 3. Potřete nátěr jódem, poté opláchněte

Pomocí pipety pokryjte nátěr jódem. Nechte působit alespoň 60 sekund, poté opláchněte stejným opatrným způsobem. Jód ve formě záporně nabitých iontů interaguje s CV+ za vzniku velkých komplexů krystalové violeti a jódu (komplexy CV – I) ve vnitřní a vnější vrstvě buňky. To zachytí fialovou krystalovou fialovou barvu v buňce, ať už se obarví kdekoli.

Jód je žíravý. Vyvarujte se vdechnutí, požití nebo kontaktu s pokožkou

Gram Stain Krok 9
Gram Stain Krok 9

Krok 4. Přidejte odbarvovač a poté rychle opláchněte

K tomuto kritickému kroku, který musí být pečlivě načasován, se obvykle používá směs acetonu a ethanolu v poměru 1: 1. Podržte sklíčko pod úhlem a poté přidejte odbarvovač, dokud již nebude v odtokovém odtoku vidět fialovou barvu. To obvykle trvá méně než 10 sekund, nebo dokonce kratší dobu, pokud odbarvovač obsahuje vyšší koncentrace acetonu. Okamžitě zastavte, jinak odbarvovač odstraní krystalově fialové barvivo z grampozitivních i negativních buněk a barvení bude nutné opakovat. Přebytečný odbarvovač okamžitě opláchněte předchozí technikou.

  • Místo toho lze použít čistý (95%+) aceton. Čím více acetonu je, tím rychleji bude odbarvovač pracovat, což vyžaduje přesnější načasování.
  • Pokud máte potíže s načasováním tohoto kroku, zvažte přidání odbarvovače po kapkách.
Gram Stain Krok 10
Gram Stain Krok 10

Krok 5. Potřete nátěr kontrastním barvením a poté opláchněte

Kontrastní barvivo, obvykle safranin nebo fuchsin, se používá k přidání extra kontrastu mezi gramnegativními a grampozitivními bakteriemi barvením odbarvených (gramnegativních) bakterií na růžovou nebo červenou. Nechte působit alespoň 45 sekund, poté opláchněte.

Fuchsin bude intenzivněji barvit mnoho gramnegativních bakterií, například haemophilus spp a legionella spp. To může být lepší volbou pro začátečníky

Gram Stain Krok 11
Gram Stain Krok 11

Krok 6. Vysušte sklíčko

Sklíčko můžete nechat uschnout na vzduchu nebo ho vyschnout pomocí bible papíru prodávaného za tímto účelem. Gramovo barvení je kompletní.

Část 3 ze 3: Zkoumání výsledku

Gram Stain Krok 12
Gram Stain Krok 12

Krok 1. Připravte si světelný mikroskop

Umístěte sklíčko pod světelný mikroskop. Bakterie se velmi liší velikostí, takže celkové požadované zvětšení se bude pohybovat od 400x do 1000x. Na horním konci těchto zvětšení se doporučuje čočka s olejovým imerzním objektivem, aby byla jasnější. Na podložní sklíčko naneste kapku imerzního oleje, vyhněte se pohybu během aplikace, abyste zabránili vzniku bublin. Přesuňte věž mikroskopu tak, aby čočka objektivu zacvakla na místo a dotkla se oleje.

Ponoření do oleje lze použít pouze na speciálně navržené čočky, nikoli na „suché“čočky

Gram Stain Krok 13
Gram Stain Krok 13

Krok 2. Identifikujte grampozitivní a gramnegativní bakterie

Prohlédněte sklíčko pod světelným mikroskopem. Grampozitivní bakterie vypadají purpurově, díky krystalové fialce uvězněné v jejich tlustých buněčných stěnách. Gramnegativní bakterie vypadají růžově nebo červeně, protože fialka se promývala tenkými buněčnými stěnami a poté do nich vstoupilo růžové kontrastní barvivo.

  • Pokud je vzorek příliš silný, mohou se zobrazit falešně pozitivní výsledky. Pokud jsou všechny druhy bakterií grampozitivní, obarvěte nový vzorek, abyste se ujistili, že výsledek je správný.
  • Pokud odbarvovač běžel příliš dlouho, můžete vidět falešně negativní výsledky. Pokud jsou všechny typy bakterií gramnegativní, obarvěte nový vzorek, abyste zkontrolovali své výsledky.
Gram Stain Krok 14
Gram Stain Krok 14

Krok 3. Vyhledejte referenční obrázky

Pokud si nejste jisti, co je to bakterie, prohlédněte si sbírku referenčních obrázků seřazených podle tvaru a výsledku gramového barvení. Databáze můžete najít online v Národní databázi mikrobiálních patogenů a na mnoha dalších webech. Aby byla identifikace snazší, jsou běžné nebo diagnosticky důležité příklady seřazeny níže podle gramů a tvaru.

Gram Stain Krok 15
Gram Stain Krok 15

Krok 4. Identifikujte grampozitivní bakterie podle tvaru

Bakterie jsou dále klasifikovány podle tvaru pod mikroskopem, nejčastěji jako koky (sférické) nebo tyčinky (válcovité). Zde je několik běžných grampozitivních (purpurově zbarvených) bakterií uspořádaných podle tvaru:

  • Grampozitivní koky jsou obecně buď stafylokoky (což znamená koky v klastrech) nebo streptokoky (což znamená koky v řetězcích).
  • Grampozitivní tyčinky zahrnují Bacillus, Clostridium, Corynebacterium a Listeria. Actinomyces spp. tyče mají často větve nebo vlákna.
Gram Stain Krok 16
Gram Stain Krok 16

Krok 5. Identifikujte gramnegativní bakterie

Gramnegativní (růžově zbarvené) bakterie jsou často klasifikovány do tří skupin. Cocci jsou sférické bakterie, tyčinky jsou dlouhé, tenké bakterie a cocoidové tyčinky jsou někde mezi nimi.

  • Gram-negativní koky jsou nejčastěji Neisseria spp.
  • Gramnegativní tyčinky patří E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas a mnoho dalších. Vibrio cholerae se může jevit jako obyčejné tyče nebo zakřivené tyče.
  • Gramnegativní tyčinky „coccoid“(nebo „coccobacilli“) patří Bordetella, Brucella, Haemophilus a Pasteurella.
Gram Stain Krok 17
Gram Stain Krok 17

Krok 6. Vyhodnoťte smíšené výsledky

Některé bakterie je obtížné přesně obarvit kvůli křehkosti nebo voskovitosti jejich buněčných stěn. Mohou mít směs fialových nebo růžových skvrn ve stejné buňce nebo mezi různými buňkami ve stejném nátěru. Tento problém může mít jakýkoli vzorek bakterie starší 24 hodin, ale některé druhy je obtížné barvit v každém věku. Mohou vyžadovat specializovanější testy ke zúžení identifikace, jako je kyselé rychlé barvení, pozorování růstu kultury, střední kultury TSI nebo genetické testování.

  • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium a Propionibacterium spp. všechny jsou považovány za grampozitivní bakterie, ale často vypadají bezvýsledně obarvené.
  • Malé a štíhlé bakterie, jako je Treponema, Chlamydia a Rickettsia spp. jsou obtížně gramovatelné správně.
Gram Stain Krok 18
Gram Stain Krok 18

Krok 7. Zlikvidujte materiály

Postupy likvidace odpadu se mezi laboratořemi liší podle použitých materiálů. Obvykle je kapalina v barvicí misce likvidována v uzavřených lahvích jako nebezpečný odpad. Sklíčka namočte do 10% roztoku bělidla a poté je zlikvidujte v nádobách na ostré předměty.

Tipy

  • Pamatujte, že výtěžek na Gramově barvení je jen tak dobrý jako vzorek. Je důležité naučit pacienty poskytovat dobré vzorky (např. Rozdíl mezi pliváním a hlubokým kašlem u vzorků sputa).
  • Jako odbarvovač působí ethanol pomaleji než aceton.
  • Dodržujte standardní laboratorní opatření.
  • K procvičení použijte tampon na tvář, protože vzorek by měl obsahovat grampozitivní i gramnegativní bakterie. Pokud vidíte pouze jeden nebo jiný typ, pravděpodobně používáte příliš málo nebo příliš mnoho odbarvovače.
  • K uchopení skluzavky můžete použít dřevěný kolíček na prádlo.

Varování

  • Aceton a ethanol jsou hořlavé. Aceton odstraní z rukou oleje, což způsobí, že vaše pokožka snadněji absorbuje jiné chemikálie. Používejte rukavice a používejte opatrně.
  • Nenechte nátěr zaschnout, než skvrnu opláchnete nebo kontrastně zabarvíte.

Doporučuje: