Zásoba glycerolu je typ suspenze používané v laboratorních podmínkách k dlouhodobému skladování bakteriálních kultur. Když se kapalné bakteriální kultury přidají do 50% roztoku glycerolu, glycerol se infuzuje do bakteriálních buněk, čímž je strukturálně stabilní a umožňuje jejich bezpečné skladování. Po smíchání vzorky zmrazte na -80 ° C (-112 ° F), abyste zajistili, že zůstanou životaschopné co nejdéle.
Kroky
Část 1 ze 3: Míchání roztoku glycerolu
Krok 1. Připravte si tekutou kulturu bakterií, které chcete uložit
Aby byla zásoba glycerolu účinná, musí být kombinována s kapalnou bakteriální kulturou. Produkce kapalné kultury bude vyžadovat inkubaci bakteriálního vzorku přes noc v Erlenmeyerově baňce naplněné lyzogenním bujónem a správnou koncentrací antibiotika.
- Jakmile připravíte tekutou kulturu, můžete bakterie uložit do zásoby nebo pokračovat v izolaci plazmidové DNA.
- Lysogeny bujón (také známý jako „LB vývar“a „LB kapalina“) je druh tekutiny bohaté na živiny, která se používá k rychlé propagaci bakterií. Lze jej zakoupit u prodejce, který prodává laboratorní vybavení a materiál.
- Inkubace bakteriálních kultur je vysoce technický proces zahrnující mnoho různých proměnných. Z tohoto důvodu je nejlepší jej provádět vyškolený technik v kontrolovaném laboratorním prostředí.
Krok 2. Čistý glycerol zřeďte v destilované vodě, abyste vytvořili 50% roztok glycerolu
Pomocí sterilní pipety odměřte 10 ml obou kapalin a spojte je do jedné baňky. Baňku důkladně promíchejte nebo protřepejte, dokud nebudou kapaliny rovnoměrně promíchány.
- Zředění glycerolu je nezbytné, aby se zabránilo poškození bakteriálních buněk.
- Někteří vědci dávají přednost použití roztoku glycerolu tak nízkého jako 15-40%, aby se vyhnuli ohrožení bakteriální kultury. 50% směs však zajistí maximální životnost při skladování.
Krok 3. Přeneste 50 mikrolitrů 50% roztoku glycerolu do mikrocentrifugační zkumavky
Zředěný glycerol přesuňte opatrně do nové lahvičky, aby nedošlo k rozlití. Stejnou nádobu použijete k infuzi roztoku glycerolu s kapalnou bakteriální kulturou a umístěním vzorku do chladírny.
Pokud je to možné, použijte spíše trubici se šroubovacím vrcholem než trubku se západkou. Je známo, že se zkumavky s přichycením otevírají náhodně během míchání a delšího skladování
Část 2 ze 3: Přidání bakteriální kultury
Krok 1. Do roztoku přidejte 50 mikrolitrů kapalné bakteriální kultury
Pomocí čerstvé pipety odměřte stejné množství kapalné kultury a nalijte ji přímo do roztoku glycerolu ve zkumavce. Konečný podíl vaší zásoby glycerolu by měl být 50% bakterií a 50% zředěného glycerolu.
- Použití nepřiměřeného množství glycerolu a kapalné kultury by mohlo ovlivnit odolnost bakterií a zkrátit dobu, po kterou je schopna přežít v chladírně.
- Pokud používáte roztok glycerolu s nižší koncentrací, budete muset podle toho upravit množství bakteriální kultury. Další informace najdete v literatuře týkající se přesného kmene, který ukládáte.
Krok 2. Umístěte víčko na zkumavku
Přišroubujte víko na místo nebo zatlačte dolů, dokud neuslyšíte jemné cvaknutí, pokud používáte zaklapávací horní trubku. Před pokračováním zkontrolujte, zda je víko zajištěno.
Krok 3. Zkumavku jemně protřepejte, aby se smíchala bakteriální kultura a glycerol
Zkumavku několikrát promíchejte tam a zpět, dokud nebudou obě kapaliny rovnoměrně rozloženy. V tomto okamžiku bakteriální buňky pomalu začnou absorbovat roztok glycerolu, který stabilizuje a chrání buněčnou membránu před poškozením a poškozením souvisejícím s teplotou.
Při třepání držte palec pevně přitlačený k víku zkumavky s mikroprůchodem, abyste se ujistili, že se neuvolní
Část 3 ze 3: Uchovávání a obnova bakteriálních kultur
Krok 1. Označte bakteriální vzorek
Napište název kultury na malý štítek se zkumavkou nebo proužek maskovací pásky a přilepte jej na zkumavku s mikroobjemem, kde bude jasně viditelný. Informace o klasifikaci bakterií můžete také zaznamenat přímo na víko pomocí fixu s plstěným hrotem.
- Nezapomeňte také zaznamenat jakékoli další informace, které se mohou ukázat jako užitečné při analýze, například přesný kmen vzorku nebo jeho původ.
- Označení vašich vzorkových nádob je nepostradatelným krokem v procesu sběru, protože vám umožňuje sledovat jejich obsah, jak jsou míchány kolem a mimo sklad.
Krok 2. Zmrazte vzorek na -80 ° C (-112 ° F)
Umístěte označený vzorek do podchlazeného laboratorního mrazáku nastaveného na konstantní teplotu −80 ° C (−112 ° F). Pokud se bakteriální kultura uchovává za těchto podmínek, zůstane životaschopná několik let.
Je důležité, aby teplota mrazničky zůstala pevně nastavena na -80 ° C (-112 ° F). Pokud je nastaveno tepleji, konzervované bakterie mohou zemřít
Krok 3. Oškrábejte malé množství zmrazených bakterií, abyste je připravili k analýze
Až přijde čas na oživení vzorku, vyjměte zkumavku z mikroskopu z mrazničky a otevřete víko. Pomocí sterilní očkovací smyčky, párátka nebo špičky pipety odeberte malé množství zmrazeného materiálu z horní části vzorku a naneste bakterie na LB agarovou destičku pro vyšetření nebo testování.
- Dávejte pozor, aby se bakterie škrábající nerozmrazily. Může pomoci uchovat zásobní zkumavku na suchém ledu, dokud nedokončíte testy.
- Vytáhněte vzorek z mrazničky pouze v nezbytně nutných případech. Opakované rozmrazování a opětovné zmrazování výrazně sníží jeho životnost.